共聚焦顯微鏡中的圖像是來自一個焦平面的光通過針孔數碼相機聚焦拍攝，從而規避 來自其支點上方或下方的光。固定在設備上的激光連續聚焦在樣品的選定區域，同時，被樣品吸附的熒光染料也會被數碼相機捕捉。共聚焦設備包含兩個旋轉鏡頭用來拍攝組圖。

然后通過所累積的不同焦平面的圖像序列，使用軟件編譯完整的 3d 圖像。此圖像可以在軸向（z 軸）和橫向（x 和 y 軸）平面進行微調。這些細胞和其他矩陣的再現是通過使用雙倒置的光錐照亮物體來實現的。

使用標準落射熒光顯微鏡所存在的問題是當遇到較厚的基質或標本時所表現出的熒光程度較大。大于 2 微米的樣品發出的輻射會危及生成圖像的準確性，從而損失成像的細節。而共聚焦顯微鏡則可以通過縮小激發范圍并使用光學切片來消除背景噪聲。